Illumina测序原理

Illumina测序是一种基于边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）的高通量测序技术，其原理主要包括以下几个步骤：

1. 文库制备

片段化：将待测DNA片段通过酶切、超声波打断等方法随机打碎成200~800bp的片段。

末端修复与接头连接：对随机打断的双链DNA片段进行末端修复，使其两端平齐，并在两端连接上特异性接头序列。

PCR扩增：对连接了接头的DNA片段进行PCR扩增，以增加DNA片段的数量。

2. 簇生成（Cluster Generation）

流动槽（Flow Cell）杂交：流动槽表面固定有与接头互补的寡核苷酸片段，将文库DNA片段与流动槽表面的寡核苷酸片段杂交。

桥式PCR扩增：通过桥式PCR扩增，将单拷贝DNA分子扩增成簇，形成数百万个DNA簇。每个簇包含数千个相同的DNA分子，便于光学成像系统捕捉荧光信号。

3. 测序

边合成边测序：向反应体系中加入DNA聚合酶、接头引物和带有荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3’端羟基被化学方法保护，每次只能添加一个dNTP。

荧光信号检测：在dNTP被添加到合成链上后，洗脱未使用的dNTP和DNA聚合酶，加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并由光学设备记录荧光信号。

信号处理与循环：将荧光信号转化为碱基序列信息，然后加入化学试剂猝灭荧光信号并去除dNTP 3’端羟基保护基团，进行下一轮测序反应。

4. 数据分析

数据处理：将测序产生的数百万个reads进行处理，通过在文库构建过程中引入的独·特index分离不同样本的序列。

序列拼接与比对：将正向和反向reads配对，生成连续序列，并与参考基因组进行比对分析。

Illumina测序技术因其高通量、低成本、高准确度等优势，成为目前应用最·广泛的二代测序平台。

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